1、哪種柱子可以反沖，哪種不可以?反沖后是正著用，還是反著用？

答：一般的正相、反相柱應(yīng)該都能反沖，只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱的柱子不能反沖，不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉，反沖后還是正著用比較好，以免柱子的兩頭都被污染。我們一直提倡的是：正向使用，反向沖洗。

2、方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候，用乙腈和水作為流動(dòng)相，在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，剛開(kāi)始用60%乙腈，RT為2.5分鐘，調(diào)到40%乙腈，RT沒(méi)有變化，30%也沒(méi)有變化，一直調(diào)到20%的時(shí)候，RT突然變到了約13分鐘，請(qǐng)問(wèn)什么原因（用的是離子交換柱）？

答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單，需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析。譬如分析物是什么情況，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)?水相是什么緩沖鹽?對(duì)于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做?

3、對(duì)于一根常用的c18柱，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么?

答：新柱活化，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程，除了用流動(dòng)相平衡外，有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡，特別是測(cè)定分子量比較高的多肽，尤其重要。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子，擴(kuò)散速度慢，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng)。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單，多進(jìn)幾次樣品，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。如果要加快平衡時(shí)間，把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大，或者不等洗脫完成，連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡，目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。

4、如果柱子長(zhǎng)時(shí)間不用，需要如何儲(chǔ)存?

答：對(duì)一般的反相柱，也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭，以免保存溶劑揮發(fā)，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù)。

5、什么原因?qū)е路灞仍瓉?lái)大，而且出現(xiàn)的早?

答：過(guò)快、過(guò)大的峰通常是由于從分流口和隔墊吹掃口排出的載氣減少，而更多的進(jìn)入色譜柱;因此增加柱頭壓力，可降低分流比。檢查分流出品的氣體流量，如需調(diào)整分流比則對(duì)調(diào)整此流量。如果問(wèn)題依然存在，可卸下并清潔分流口。這個(gè)問(wèn)題也可能由于柱頭壓調(diào)節(jié)閥有問(wèn)題而引起。

6、預(yù)柱或保護(hù)柱是不是必需？安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎?

答：加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞，肯定有害于分離度和柱效，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在，但是如果保護(hù)柱接得好，并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大。

7、何時(shí)需更換隔墊或襯管?

答：通常比較好的隔墊至少能保證100次進(jìn)樣不發(fā)生問(wèn)題。當(dāng)色譜特征說(shuō)明襯管有問(wèn)題時(shí)，需要更換襯管。影響隔墊壽命的因素有注射器尺寸、進(jìn)樣口溫度和壓力，當(dāng)然受壓力影響的程度比較小。影響襯管壽命的因素通常是樣品的清潔度。應(yīng)該根據(jù)儀器維護(hù)歷史記錄來(lái)選擇色譜需要的特定程序。

8、Atlantis C18柱可以用較高比例的流動(dòng)相，那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗?在什麼體系中保存比教合適?

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護(hù)：流動(dòng)相中不含緩沖鹽分析完成后，用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min流動(dòng)相中含有緩沖鹽，分析完成后，先用甲醇(或乙腈)：水=10：90反向沖洗45min，然后再用甲醇(或乙腈)：水=90：10反向沖洗色譜柱45min;(注意：甲醇(或乙腈)：水=10：90容易長(zhǎng)菌，使用時(shí)間不可超過(guò)3天);水性柱保存體系也不特別：短期保存在所用的流動(dòng)相中(不含緩沖鹽)，中長(zhǎng)期保存在純甲醇(乙腈)或80%的甲醇(乙腈)/水中。

9、正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適?

答：短期和長(zhǎng)期都建議保存在正相測(cè)定所用的流動(dòng)相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇。

10、同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后，再分析苯甲酸、山梨酸、糖精鈉時(shí)為什么保留時(shí)間會(huì)提前?

答：色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染后，保留時(shí)間提前和滯后的情況都有，具體要看污染物的性質(zhì)，還要看分析物、固定相和污染物三者共同作用的情況，情況比較復(fù)雜，有時(shí)候比較難預(yù)測(cè)是提前還是滯后。不過(guò)你平時(shí)維護(hù)的時(shí)候，注意在測(cè)定后將污染物用有機(jī)溶劑反沖清洗，就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn)。建議每個(gè)分析方法用專門的色譜柱，長(zhǎng)遠(yuǎn)看，這樣更節(jié)省色譜柱的費(fèi)用。

11、怎么通過(guò)選擇合適的柱子來(lái)提高分離度?

答：提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來(lái)考慮，柱效、選擇性和保留因子?？赏ㄟ^(guò)減小填料粒徑和增加柱長(zhǎng)提高柱效;選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān)，通過(guò)選擇合適的色譜柱和合適的pH，可以提高選擇性;有時(shí)候適當(dāng)延長(zhǎng)出峰時(shí)間增加保留因子，也可提高分離度。

12、流動(dòng)相走空了，液相色譜柱還能用嗎?如果可以應(yīng)該如何再生?

答：能用的!可能柱子里會(huì)有氣泡進(jìn)去，但之后多用流動(dòng)相沖沖，看到基線穩(wěn)定，就沒(méi)問(wèn)題了。用色譜柱的保存液低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗，然后再檢測(cè)一下柱效，看柱子是否恢復(fù)，液相最好設(shè)置一下最低壓限，這樣就不怕流動(dòng)相走光而會(huì)損傷色譜柱。

13、如何改善峰形?(前伸峰、拖尾峰)

答：前伸峰是由于色譜柱過(guò)載。當(dāng)一種或多種化合物的進(jìn)樣量超過(guò)色譜柱固定相容量時(shí)，可能發(fā)生這種情況。液相膜越薄，色譜柱中保留的每種化合物就越少。這涉及到進(jìn)樣體積和進(jìn)樣中每個(gè)峰的化合物濃度。通過(guò)減少進(jìn)樣量、分流樣品或進(jìn)樣濃度較低的樣品，可減小進(jìn)樣體積。

14、氨基柱時(shí)，有時(shí)候峰型突然變寬，有拖尾，用一段時(shí)間就又好了，什么原因，如何再生?如果可以沖的話，一般沖多久?

答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高(大約有1mol/L)，在有水存在的時(shí)候，在孔內(nèi)形成一個(gè)pH10左右甚至超過(guò)10的很強(qiáng)的堿性小環(huán)境，并會(huì)導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解。不過(guò)硅膠基體的溶解會(huì)生成酸性的硅醇基，又會(huì)降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進(jìn)程。一段時(shí)間后，兩個(gè)相反的過(guò)程會(huì)達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來(lái)。對(duì)你問(wèn)題提到的這個(gè)現(xiàn)象，我想到的是這個(gè)原因。

氨基柱，要看氨基柱的應(yīng)用模式，是正相還是HILIC?這兩種模式的情況是大不相同的。正相使用，一般很怕有水。但HILIC模式應(yīng)用，一般流動(dòng)相是乙腈/水，是不怕水的。不過(guò)鍵合氨丙基基團(tuán)非常容易水解，所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時(shí)，流動(dòng)相中要求一點(diǎn)都不能含水，但清洗柱子上的污染物質(zhì)，是可以含水的，因?yàn)樗袕?qiáng)極性，在正相色譜上洗脫能力極強(qiáng)，當(dāng)然不必用100%純水。氨基柱具體沖洗方法，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法。

15、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性環(huán)境中，會(huì)對(duì)柱子有什么損壞嗎?pH在2左右。

答：pH2左右容易使鍵合在硅膠基質(zhì)上的固定相水解流失，包括C18和封尾試劑的水解，封尾試劑相對(duì)更容易水解。不知道你保存的酸性環(huán)境是不是含有緩沖鹽，如果不含緩沖鹽，只是短期幾天保存在酸性流動(dòng)相中，也不必過(guò)份擔(dān)心，最多相當(dāng)于這幾天一直在使用這根色譜柱，因此減少幾天的使用壽命吧;有緩沖鹽就麻煩一點(diǎn)，保存期間水分揮發(fā)可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽結(jié)晶在柱內(nèi)析出，對(duì)柱子損傷很大。

16、色譜柱的安裝有什么技巧?還有所謂的死體積怎么測(cè)定呢?

答：色譜柱安裝技巧不多，只要接頭和柱頭匹配，確實(shí)擰緊不漏就可以了，但也要注意不要擰得太緊以至于損傷螺紋。所謂死體積就是完全不保留的物質(zhì)出峰時(shí)從進(jìn)樣到流過(guò)色譜柱的總體積，一般用極性非常強(qiáng)的尿嘧啶的出峰來(lái)測(cè)定。死體積包括柱體積(色譜柱內(nèi)溶劑能占據(jù)的空腔體積)和柱外體積兩部分。你從廠商這里買到色譜柱，柱體積已經(jīng)是固定了，你能盡量避免減少的是柱外體積。進(jìn)樣器內(nèi)死體積、毛細(xì)管長(zhǎng)度、毛細(xì)管和色譜柱連接緊湊與否，保護(hù)柱或在線濾器產(chǎn)生的死體積大小，都對(duì)這個(gè)有影響。樣品在柱內(nèi)，除擴(kuò)散外，還有和填料作用引起的組分分離;但樣品在柱外，那就只有擴(kuò)散這個(gè)使柱效下降的因素了。

所以，要取得好的分離效率，柱外體積應(yīng)該是越小越好。峰有時(shí)候前延，有時(shí)候拖尾，一般不是色譜柱的問(wèn)題，應(yīng)該是樣品和色譜柱填料的作用問(wèn)題，可以說(shuō)如果色譜柱類型選擇沒(méi)問(wèn)題，關(guān)鍵就是色譜條件的選擇。包括進(jìn)樣量、樣品溶劑、流動(dòng)相組成(包括添加劑)、流動(dòng)相pH以及柱溫，都對(duì)峰形有影響。另外測(cè)定分子量較大的多肽，用樣品老化平衡色譜柱很重要，分子量越大的物質(zhì)，需要平衡時(shí)間越長(zhǎng)。如果柱子沒(méi)平衡好，峰形也可能會(huì)不正常。所以最好把你具體的測(cè)定條件也列一下，也便于有針對(duì)性的分析原因。

17、柱塞板可不可拆下用超聲波清洗，會(huì)有什么不良后果?

答：不建議將柱篩板拆下清洗，因?yàn)椴鹣鲁袎旱闹Y板會(huì)導(dǎo)致柱床發(fā)生變化，影響色譜性能。應(yīng)該對(duì)污染的色譜柱先進(jìn)行清洗維護(hù)，維護(hù)沒(méi)有效果，再把拆洗柱篩板作為最后的手段。

18、CN基柱應(yīng)該怎樣維護(hù)才好呢?比如做完實(shí)驗(yàn)用什么流動(dòng)相沖柱子、短期用什么溶劑保存、長(zhǎng)期用什么溶劑保存等等。

答：CN可作正相柱，也可作反相柱用，除了保存溶劑有特殊要求外，其它維護(hù)辦法和一般正相和反相柱沒(méi)有多大區(qū)別。

19、色譜分析運(yùn)行時(shí)，標(biāo)樣和樣品的峰均隨時(shí)間加寬

答：如果保留時(shí)間沒(méi)有很大區(qū)別，只是加寬的峰拖尾，可能表明有活化點(diǎn)。如果加寬的峰是對(duì)稱的，可能是由于正常的色譜柱“損耗和流失”。如果峰前伸，說(shuō)明色譜柱過(guò)載。

20、排除色譜柱流失問(wèn)題的最佳方法是什么?

答：診斷色譜柱是否存在流失問(wèn)題的最佳方法是第一次在方法條件下安裝色譜柱時(shí)，做一次空白色譜圖，然后將最近的運(yùn)行和空白運(yùn)行色譜圖對(duì)比。如果在空白運(yùn)行中產(chǎn)生了很多峰，則色譜柱性能改變，這可能是由于載氣中含有氧氣，也可能是由于樣品殘留。如果有GC-MS，則低極性色譜柱的典型流失離子(例如DB/HP-1或5)質(zhì)/荷比m/z將為207、73、281、355等，大多數(shù)為環(huán)硅氧烷。

21、請(qǐng)問(wèn)我做一種藥的分析，查美國(guó)藥典規(guī)定使用100mm×40mm8μm色譜柱，流速3mLmin。可現(xiàn)在市場(chǎng)上已不容易找到這種規(guī)格的產(chǎn)品，于是我按USP中色譜柱比較的數(shù)據(jù)庫(kù)的指引，選了一款選擇性一致的等價(jià)色譜柱，其規(guī)格是100mm×46mm3μm的色譜柱，當(dāng)選用3mLmin的流速時(shí)發(fā)現(xiàn)柱壓超高，請(qǐng)問(wèn)我如何對(duì)方法進(jìn)行調(diào)整以滿足USP的要求?

答：流速調(diào)整原則是流動(dòng)相通過(guò)柱子的線速度一致，等價(jià)柱的截面積大了，流速也應(yīng)增加才能保持相同的線速度。新流速計(jì)算結(jié)果是：(4.6/4.0)2x3.0=4.0ml/min。但3ml/min流速都已導(dǎo)致柱壓太高，4.0ml/min明顯不行。好在USP還有個(gè)允許±50%的流速調(diào)整指導(dǎo)原則，這樣將流速調(diào)至2.0ml/min既符合USP規(guī)定，又能使柱壓降到可接受的范圍，但這種改變不能引起其它不好后果。這個(gè)例子中，等度分析中，流速改變會(huì)引起塔板數(shù)和峰寬的改變，但不會(huì)影響峰的選擇性。3um粒徑色譜柱柱效比8um的高很多，可考慮縮短柱長(zhǎng)以補(bǔ)償或部分補(bǔ)償流速降低造成的測(cè)定時(shí)間增加。所以，更佳選擇是50mm×4.6mm，3μm的柱子，2.0ml/min的流速運(yùn)行，可以在符合USP規(guī)定的情況下，又得到更快速的測(cè)定分離。

22、最近我非常的沮喪，按照藥典上的色譜條件和方法做某藥物的分析，卻始終得不到滿意的結(jié)果。有人建議我對(duì)色譜條件，如進(jìn)樣量、流動(dòng)相pH和溫度等，進(jìn)行微調(diào)以得到良好的峰形和分離效果，可按公司規(guī)定我不能這樣做，怎么辦?

答：如果你心里老有這個(gè)思維定勢(shì)“按規(guī)定，我不能......”，然后什么也不敢做，那真是不好辦!只有去做了，去試著改變條件看看得到什么結(jié)果，你才能發(fā)現(xiàn)問(wèn)題所在。如果改變條件后，仍得不到好結(jié)果，就要去找色譜條件以外的原因，如色譜柱、色譜儀器以及樣品和制樣過(guò)程中的是否存在問(wèn)題?不管通過(guò)微調(diào)你是否取得了好結(jié)果，你也有了向領(lǐng)導(dǎo)匯報(bào)問(wèn)題和解決方案的依據(jù)。而且，絕對(duì)不能調(diào)整藥典規(guī)定色譜條件的說(shuō)法通常是不對(duì)的。美國(guó)藥典USP說(shuō)的是如果改變藥典方法需要重新做方法驗(yàn)證，但方法調(diào)整或者稱微調(diào)以符合系統(tǒng)適應(yīng)性的要求是允許的，是不需要重新做方法驗(yàn)證的。USP列了調(diào)整的幾條指導(dǎo)原則，如±50%的流速調(diào)整，±10℃的溫度調(diào)節(jié)等等(詳見(jiàn)"Chapter 621，Chromatography，" United States Pharmacopeia No. 31-NF 26， (2008).)。當(dāng)然既然是指導(dǎo)原則，這些規(guī)定都不是絕對(duì)的，如溫度調(diào)整±10℃，對(duì)有些方法適用，對(duì)另外的方法則±5°C的調(diào)整都會(huì)有問(wèn)題，我們應(yīng)該依據(jù)具體情況作出明智的科學(xué)判斷。

23、峰形后拖尾是什么原因造成的?

答：[柱物理?yè)p壞] 色譜柱有物理?yè)p壞是造成峰形拖尾的根源。唯一的解決方法就是更換新柱。

[柱內(nèi)填料污染] 流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純，盡量使用色譜純?cè)噭?。流?dòng)相所用的水最好是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。用前先用0.45um溶劑微孔過(guò)濾(器)過(guò)濾，除去可能存在的微粒。流動(dòng)相建議現(xiàn)用現(xiàn)配，對(duì)于含鹽的溶液尤其注意長(zhǎng)置會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。此外還得保證儲(chǔ)存流動(dòng)相的容器清潔。

復(fù)雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過(guò)濾(器)或樣品預(yù)處理柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。柱內(nèi)填料污染時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料，再以相同的填料重新填入，修復(fù)?；蛞阅苋芙馕廴疚锏牧鲃?dòng)相按色譜柱使用的相反方向，沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積，或視具體情況而定;另外，此時(shí)不能接檢測(cè)器)，將污染物沖出色譜柱，再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。

[柱進(jìn)口處有異物] 當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí)，可將柱頭螺絲卸下，取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中，用超聲波清洗約20分鐘，再置于超純水中，并用超聲波清洗約10分鐘，重新裝入色譜柱內(nèi)即可。

[樣品濃度過(guò)高致使柱超載] 樣品在柱上超載能引起峰展寬，拖尾(或伸舌)。適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度(需要時(shí)，可提高檢測(cè)器靈敏度)直至峰形和保留時(shí)間不再改變，便可消除這種不良影響。減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下，樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3～50ug范圍內(nèi)，不會(huì)引起明顯超載。

[樣品溶劑不對(duì)] 選擇合適的樣品溶劑，以排除不必要的干擾。最好選用流動(dòng)相溶解樣品。

[柱外效應(yīng)]即進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測(cè)器間的管路過(guò)長(zhǎng)、直徑過(guò)粗、管路接頭不匹配、有死體積，是影響色譜柱柱效的主要因素之一。所以在可能的條件下，色譜柱的兩端連接管路要盡可能短，連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小，切口務(wù)必平整光滑，盡可能的減小死體積，以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。

[緩沖不足或不合適] 在緩沖不好或離子強(qiáng)度過(guò)低的分離中，也會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。

[硅醇基團(tuán)作用] 仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知：反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半，其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。但是，酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理，因此，發(fā)生了峰形拖尾。為了減小峰形拖尾，通?？稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用，以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行，并大大緩解了峰形拖尾。使用長(zhǎng)鏈的硅醇基抑制劑，雖起效較慢，但持續(xù)力較三乙胺長(zhǎng)。因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外，大分子中非極性部分與固定相也會(huì)發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果將抑制劑加至樣品中，效果會(huì)顯著。

[柱內(nèi)金屬污染] 柱內(nèi)金屬污染(Fe，Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn)，也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片，隨流動(dòng)相沉積到柱填料中。例如C18柱填料被金屬污染后，造成酸性/堿性樣品拖尾，可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料，得到的峰是尖銳且對(duì)稱的。

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