在色譜分析中，流動相必不可少，那么問題來了，如何選擇流動相？當然，要看所要檢測樣品的性質了，高效液相根據色譜柱的不同分為反相和正相，常用的C18柱、C8柱為反相柱，一般反相是首選，流動相的極性大于色譜柱的極性，流動相由極性較大的水和極性較小的有機溶劑（常用的是乙腈、甲醇）按照一定的比例配制而成。當樣品為強親水性樣品時，流動相中含水時，在色譜柱上保留很弱，需采用非水反相色譜。當樣品為強疏水性樣品時，流動相中含水時，在色譜柱上保留很強，需采用正相色譜。正相色譜時，流動相比例極性小于色譜柱的極性，流動相由非極性的正己烷和極性較大的有機溶劑（二氯甲烷、丙醇、異丙醇、甲基叔丁基醚等等）按照一定的比例配制而成。
　　
流動相選擇秘訣1：由強到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然后根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。秘訣2：三倍規則：每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。秘訣3：粗調轉微調：當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，并據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
　　
常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙腈，甲醇有其性價比的優勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度;乙腈雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發生反應，用作流動相系統常用做反相流動相的溶劑是甲醇和乙腈，甲醇有其性價比的優勢，但是甲醇活性高，可能與某些樣品發生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收，會降低分析方法的靈敏度;乙腈雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強，很少與樣品發生反應，用作流動相系統壓力要比甲醇低很多，且截止波長比甲醇低20nm，增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質的可能性，所以我們一般傾向于多用乙腈，少用甲醇。但是有時候樣品峰形不好或者分離不好，更換溶劑試試是一個很好的選擇，畢竟不同的溶劑提供不同的選擇性。
　　
對流動相的優化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改善峰形、提高分離度。流動相里加堿的情況比較少，主要還是加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波長下沒有紫外吸收，而三氟乙酸在低波長下有，但是三氟乙酸易揮發而磷酸不行，所以單純做液相，低波長下磷酸最合適，三氟乙酸有吸收，運行梯度時基線漂移很嚴重，而做液質就要考慮首選三氟乙酸了，近些年還比較流行加甲酸或乙酸。一般情況下這幾種酸沒有太大區別，我們更多的是考慮通過加酸改變流動相的pH值，從而改善樣品的分離度和峰形。
　　
相同進樣量樣品峰越高則意味著峰形越好，從圖中可以看出多數樣品在低pH值下峰形都比中性要好，這個主要是由色譜柱本身的性質所決定的。色譜柱主要都是硅膠基質，現有的填料處理工藝無法將硅膠上殘余的硅羥基全部去除，硅羥基會造成樣品峰拖尾，一般認為硅羥基的pKa在3.5到4.5之間，低pH值能幫助抑制硅羥基的活性，減小拖尾，從而改善峰形，提高分離度。水溶液中添加0.1%(體積)的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流動相正好抑制硅羥基的活性，所以開發液相分析方法時流動相首選水加01.%的磷酸，然后再以此為基礎做優化。
　　
在單獨用酸不行的時候就要考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩定、緩沖能力強、配制簡單，需要調pH值時要有相應的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主要是鉀鹽和鈉鹽，再有就是醋酸鹽，常用的鹽濃度在10~20mM左右。以前因為色譜柱填料生產工藝的問題，往往需要在流動相里添加三乙胺來減少拖尾，但是三乙胺對色譜柱的壽命有很大影響，現在新的色譜柱都不再需要了。流動相里有時會需要調節pH值到堿性，具體pH要視色譜柱的耐受范圍而定，常用 NaOH、KOH溶液或氨水做為調節緩沖鹽溶液堿性pH的試劑，也可以往水里單獨添加氨水做堿性流動相。