色譜方法開發(fā)通常耗時且費(fèi)力。大家常采用的方法是，用已經(jīng)習(xí)慣使用的溶劑、pH條件、緩沖鹽、以及常用色譜柱的組合，作為起始條件，然后對流動相的比例進(jìn)行一系列的調(diào)整，直至獲得比較滿意的峰形與分離。但這樣的工作方式，通常極為耗時，而且也并不能獲得最佳分離條件。更為系統(tǒng)性的方法策略，是利用好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，并遵循以下流程，進(jìn)行高效、高質(zhì)量的反相色譜方法開發(fā)。這個方法開發(fā)流程包括：1.方法篩選：流動相pH、有機(jī)溶劑、以及色譜柱，作為對選擇性影響最大、因而也是最重要的條件因素，首先被加以篩選。2.方法優(yōu)化：對以上得到的所有結(jié)果，評估這三個因素的何種組合，獲得了最佳分離效果。在這個組合條件的基礎(chǔ)上，進(jìn)行優(yōu)化或微調(diào)，以獲得最終想要的結(jié)果。3.方法驗(yàn)證：對最終的方法進(jìn)行驗(yàn)證，檢查它是否滿足預(yù)期的分離效果與分析目的。

方法篩選的影響因素：1.PH的影響：當(dāng)分析物含有可電離官能團(tuán)時（可電離官能團(tuán)指，在不同的pH條件下可處于不同程度的電離狀態(tài)，例如：伯/仲/叔胺基、羧酸基、酚酸基），pH條件將強(qiáng)烈影響分析物的反相保留效果，pH條件的改變也會造成最強(qiáng)烈的選擇性改變效果。酸性和堿性化合物在其未電離狀態(tài)下時反相保留最大，中性化合物的保留不受pH影響。PH的選擇與色譜柱的選擇——對于帕羅西汀和它的有關(guān)物質(zhì)B、D、G、F，因其胺基結(jié)構(gòu)在不同pH條件下電離狀態(tài)不同，使用pH 10條件比pH 3條件能夠獲得更強(qiáng)的保留和更好的分離選擇性。由于具有更高分辨率和更好的選擇性，pH 10是適合被測物的pH值。下一步是評估在相同pH 10值下三種不同色譜柱的色譜圖，以選擇具有最佳分辨率的色譜柱。三種色譜柱都顯示了可檢測所有組分的能力，由于C18的通用性，因此選擇BEH C18色譜柱來對比不同有機(jī)改性劑的選擇性。2. 色譜柱的影響: 在選擇色譜柱進(jìn)行分析方法開發(fā)時，應(yīng)充分認(rèn)識，色譜填料基質(zhì)(硅膠顆粒、雜化顆粒、聚合物顆粒)因其化學(xué)性質(zhì)不同而會提供不同的保留與選擇效果。在傳統(tǒng)的HPLC系統(tǒng)上，隨著可變的pH值和有機(jī)溶劑的組合，篩選一系列的色譜柱，會花費(fèi)大量的時間。使用ACQUITY UPLC色譜柱管理器、高分辨的亞2 μm短柱，配合ACQUITY UPLC系統(tǒng)，將大大縮短這個過程，從以往的數(shù)天時間減少到數(shù)小時。3.有機(jī)溶劑的影響:甲醇和乙腈，是用于反相分離的典型有機(jī)溶劑。除了洗脫強(qiáng)度、粘度(與柱背壓有關(guān))、紫外吸收性不同，甲醇與乙腈在化學(xué)選擇性上也有所不同，甲醇可以發(fā)生氫鍵作用，因此會提供顯著不同的選擇性。甲醇，洗脫能力較弱，質(zhì)子化溶劑，提供氫鍵作用；乙腈，非質(zhì)子化溶劑，洗脫能力較強(qiáng)，粘度較低（柱背壓更低）。

方法優(yōu)化：有幾個參數(shù)可以用來調(diào)整或優(yōu)化色譜分離效果。梯度斜率是一個用來操作以控制保留和選擇性的物理參數(shù)。但是，梯度斜率經(jīng)常在分離度和靈敏度之間做平衡考量。另外一個可以優(yōu)化的參數(shù)是溫度。每個化學(xué)過程都受溫度影響，溫度可以提供明顯的不同選擇性。色譜方法開發(fā)：當(dāng)有關(guān)物質(zhì)濃度降低時，有關(guān)物質(zhì)B和D與主峰帕羅西汀的分離度明顯減少。這是由于組分與帕羅西汀峰的不同濃度水平造成。這時需要進(jìn)一步的優(yōu)化。1.方法優(yōu)化與梯度斜率：更緩的梯度斜率可以提高分離度，降低梯度斜率將降低靈敏度；更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經(jīng)常會導(dǎo)致分離度的降低，增加梯度斜率將增加靈敏度；改變梯度斜率時要平衡峰高與分離度的關(guān)系；改變保留與選擇性。2.方法優(yōu)化與溫度：減少流動相粘度；降低背壓，如果流速保持常數(shù)；提高分析物的擴(kuò)散，更高的優(yōu)化線速度；改變保留與選擇性；溫度會影響中間的每一個化學(xué)過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導(dǎo)致系統(tǒng)背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優(yōu)化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導(dǎo)致選擇性發(fā)生獨(dú)特變化。

方法驗(yàn)證提示：方法驗(yàn)證用于確認(rèn)分析方法的特性能否滿足應(yīng)用要求，驗(yàn)證過程中需要評估的典型色譜法特性是專屬性、線性、范圍、檢測限、定量限、準(zhǔn)確度、精度、穩(wěn)定性。分析方法驗(yàn)證經(jīng)常是由多個步驟組成的反復(fù)人工過程，需要進(jìn)行大量的色譜測試，以充分評估所有八種特性，審視、計算和管理這些過程獲得的所有數(shù)據(jù)可能具有一定的難度。Empower方法驗(yàn)證管理器采用自動化的驗(yàn)證過程，使數(shù)據(jù)審視更加順暢，極大提高了驗(yàn)證過程的效率和可靠性。總之，通過使用包括摸索試驗(yàn)和驗(yàn)證的方法可明顯提高色譜測試方法的開發(fā)效率。設(shè)計試驗(yàn)研究包括影響選擇性的多個參數(shù)，例如固定相、pH值、有機(jī)改性劑，自動化運(yùn)行極大加速了測試方法開發(fā)流程。合理審視數(shù)據(jù)后，完成最終測試方法經(jīng)常是微調(diào)和優(yōu)化如梯度坡度和溫度等變量的過程。為了保證所開發(fā)的方法能夠滿足應(yīng)用要求，需要使用前面確定的性能參數(shù)對方法進(jìn)行驗(yàn)證。